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mtt法检测细胞毒性原理分析

发布时间:2022-10-20 08:55人气:
  细胞活力是研究肿瘤学和药剂学的生物化学家常用的技术。细胞活力研究最常见的用途是确定细胞培养中细胞毒性化合物的 IC50。然而,正如你所料,有很多不同的时间你需要知道你的细胞是否还活着。在较大的制药公司中,细胞毒性化合物的 MTT 细胞活力研究作为一种高通量方法进行,因为公司经常筛选大量小分子药物库。为了测量细胞活力,研究人员通常使用 MTT 检测、Cell Titer Blue、台盼蓝排除或 ATP 检测。在本方法指南中,我们将介绍所有这些方法背后的理论,然后以 MTT 检测方案结束。
 
  使用 MTT 测定法测量细胞毒性
 
  通常,要测量细胞活力,您需要用试剂孵育细胞并测量试剂转化为产品的转化率。如果有很多细胞是活的,你的大部分试剂都会被转化。如果大量细胞死亡,那么您的试剂只会部分转化。对于 MTT 测定,使用的试剂是( 3 -( 4 , 5 -二甲基噻唑- 2 -yl)- 2 , 5-二苯基溴化四唑)四唑。这是一种带正电荷的小分子,经过 NADPH 介导的转化为 Formazan。
 
  由于其正电荷,MTT可以轻松进入活细胞和非活细胞。转化后,甲臜产物沉淀在细胞表面附近的细胞内,可以使用分光光度计进行检测。注意:MTT 只需要一个完整且功能正常的线粒体进行转换,因此它是一种代谢测定,而不是增殖测定。我将在未来讨论细胞增殖测定。测定技术非常简单:
 
  1.在微孔板的不同孔中培养相同数量的细胞
 
  2.添加您的细胞毒性化合物并孵育
 
  3.然后更换培养基并加入 MTT,让细胞将 MTT(蓝色)转化为 Formazan(紫色)
 
  4.将 SDS 与 DMF 或 DMSO 一起使用以重新溶解甲臜并杀死细胞(阻止它们再转化任何试剂)
 
  5.然后使用分光光度计测量产生了多少甲臜。
 
  mtt法检测细胞毒性
 
  一些研究人员甚至将 MTT 检测与流式细胞术 (FACS)结合使用,以从非活细胞中分选活细胞。然而,这种情况并不常见,并且有更好的 FACS 染色剂,例如碘化丙啶 (PI)。
 
  细胞效价蓝、台盼蓝和 ATP 检测
 
  如上所述,MTT 测定实际上是一种代谢测定,因为 MTT 分子需要进入细胞并使用 NADPH 转化为甲臜。虽然 MTT 新陈代谢的确切机制尚不清楚,但这意味着线粒体需要完好无损并发挥作用。所以,如果你添加一种会降低线粒体效率的细胞毒性物质,你可能会得到奇怪的结果。在这种情况下,了解其他活/死检测也很有用。研究中使用的其他主要细胞活力测定包括:
 
  细胞滴度蓝:与 MTT 测定类似,该测定涉及将细胞与刃天青(蓝色)一起孵育,并在细胞代谢后形成试卤灵(粉红色)。通常代谢需要 1-4 小时,但它比 MTT 检测灵敏得多,因为您可以通过荧光 (Ex/Em 560 nm/590 nm) 测量产物。这种检测的主要优点是您不需要在 DMF/SDS 中重新溶解产品,因此它更简单。这也是一个很好的高通量检测!

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